一、適用范圍與原理

 

檢測對象：豬瘟病毒（CSFV，RNA病毒）

 

方法類型：一步法熒光RT-PCR（TaqMan探針，F(xiàn)AM通道）

 

原理：反轉(zhuǎn)錄+PCR同步進(jìn)行，探針與靶序列結(jié)合后發(fā)光，實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光，以Ct值判定陰陽性。

 

二、儀器與試劑（提前準(zhǔn)備）

 

儀器

 

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（支持FAM通道）

 

高速冷凍離心機(jī)（4℃，12000g）

 

渦旋振蕩器、金屬浴/水浴、冰盒

 

無RNase離心管（1.5mL、0.2mLPCR管）、濾芯吸頭

 

試劑（無RNase）

 

無菌PBS（pH7.2–7.4）

 

RNA提取試劑盒（磁珠法/離心柱法，或TRIzol）

 

豬瘟熒光RT-PCR試劑盒（含：RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、CSFV引物探針、陽性對照、陰性對照）

 

DEPC水、75%乙醇（RNase-free）

 

三、樣品采集與處理（關(guān)鍵防降解）

 

1.樣品類型

 

選擇：脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)；其次：全血（抗凝）、血清、組織勻漿。

 

2.組織樣品處理（10%勻漿）

 

取0.1g組織，加0.9mL無菌PBS（1:9，W/V）

 

充分研磨（勻漿機(jī)/研缽）

 

4℃、12000g離心15min

 

取上清轉(zhuǎn)移至新1.5mL管，-80℃保存（避免反復(fù)凍融）

 

3.全血/血清

 

全血：EDTA抗凝，4℃≤24h，長期-80℃

 

血清：分離后同法保存

 

四、病毒RNA提取（磁珠法為例，常用）

 

取200μL樣品上清至裂解液管，渦旋1min，室溫靜置5min

 

加20μL磁珠，混勻，室溫吸附10min（每2min輕搖）

 

磁力架吸附2min，棄上清

 

加500μL洗滌液1，重懸磁珠，吸附棄上清

 

加500μL洗滌液2，重復(fù)洗滌1次

 

磁力架吸盡殘液，室溫干燥5–10min（不干透）

 

加50μL洗脫液，65℃孵育5min，洗脫RNA

 

磁力架分離，取**上清（RNA）**至新管，冰上備用（或-80℃）

 

傳統(tǒng)TRIzol法見文末附錄。

 

五、RT-PCR反應(yīng)體系配制（一步法，25μL體系）

 

在PCR潔凈區(qū)配制，冰上操作，避光。

 

1.體系配方（單管）

 

RT-PCR反應(yīng)液：19.0μL

 

酶混合液：1.0μL

 

模板RNA（樣品/對照）：5.0μL

 

總體積：25.0μL

 

2.配液步驟（N+2管，含陰、陽性對照）

 

按樣品數(shù)計(jì)算總量：(N+2)×(19+1)μL，配成預(yù)混液

 

渦旋混勻，瞬時(shí)離心

 

每0.2mLPCR管分裝20μL預(yù)混液

 

分別加入5μL模板：

 

樣品管：5μL樣品RNA

 

陰性對照：5μL陰性對照RNA/DEPC水

 

陽性對照：5μLCSFV陽性對照RNA

 

蓋緊管蓋，瞬時(shí)離心（1000g，10s），放入PCR儀

 

六、擴(kuò)增程序設(shè)置（GB/T16551-2020標(biāo)準(zhǔn)）

 

反轉(zhuǎn)錄：50℃，15min（1個(gè)循環(huán)）

 

預(yù)變性：95℃，10min（1個(gè)循環(huán)）

 

擴(kuò)增（40個(gè)循環(huán)）：

 

95℃，15s（變性）

 

60℃，60s（退火+延伸，此步采集FAM熒光）

 

七、結(jié)果判定（嚴(yán)格按Ct值）

 

1.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（必須滿足，否則試驗(yàn)無效）

 

陰性對照：無擴(kuò)增曲線，無Ct值

 

陽性對照：Ct≤32，擴(kuò)增曲線正常S型

 

2.樣品判定

 

陽性：Ct≤38，且呈典型S型擴(kuò)增曲線

 

可疑：38＜Ct＜40，需復(fù)檢（重新提取RNA+復(fù)測）

 

陰性：Ct≥40或無擴(kuò)增曲線

 

八、關(guān)鍵注意事項(xiàng)（防污染+防假陰/假陽）

 

分區(qū)操作：樣品處理→配液→擴(kuò)增，三區(qū)隔離，專用移液器

 

防RNase：全程無RNase耗材，戴手套、口罩，避免說話

 

防交叉污染：濾芯吸頭、離心管一次性使用；陽性對照最后加

 

RNA質(zhì)量：組織樣品盡快處理，避免反復(fù)凍融；A260/A280=1.8–2.0

 

儀器校準(zhǔn)：PCR儀定期校準(zhǔn)溫度與熒光通道

 

附錄：TRIzol法RNA提取（傳統(tǒng)方法）

 

200μL樣品+800μLTRIzol，渦旋1min，室溫5min

 

加200μL氯仿，渦旋30s，室溫3min

 

4℃、12000g離心15min，取上層水相（約500μL）

 

加500μL預(yù)冷異丙醇，混勻，-20℃靜置30min

 

4℃、12000g離心15min，棄上清

 

加600μL75%乙醇洗滌，4℃、12000g離心10min，棄上清

 

重復(fù)洗滌1次，吸盡殘液，室溫干燥5min

 

加40μLDEPC水+2μLRNase抑制劑，溶解RNA，冰上備用