一、試驗前準備

 

1.儀器耗材

 

熒光定量PCR儀、高速冷凍離心機、組織勻漿機、磁力架、無RNase槍頭/離心管、研缽、DEPC水、商品化豬瘟熒光RT-PCR試劑盒（一步法，靶標5’UTR保守區，FAM探針）、75%乙醇、無水乙醇。

 

2.對照設置（每批次必加）

 

陰性提取對照（NEC）：無菌生理鹽水，同步提取RNA

 

無模板對照（NTC）：DEPC水替代模板RNA

 

陽性對照（PC）：試劑盒CSFV陽性RNA

 

3.安全要求

 

全程戴無粉手套、口罩；樣本、廢液高壓滅菌；槍頭一次性使用，嚴禁跨區帶回。

 

二、第一步：樣品采集與前處理

 

1.各類樣品處理

 

1）組織樣品（扁桃體、脾臟、淋巴結很優）

 

取50～100mg組織，加5倍體積DEPC生理鹽水，勻漿充分；4℃、3000g離心15min，取上清200μL用于RNA提取分析測試百...。

 

2）EDTA抗凝血

 

混勻后直接取200μL血漿/全血裂解提取。

 

3）口鼻拭子、糞便

 

拭子浸泡1mL生理鹽水振蕩10min；糞便加1mL生理鹽水渦旋，3000g離心15min，取上清200μL。

 

4）細胞培養液

 

反復凍融3次，取200μL上清。

 

2.樣品暫存

 

提取前2～8℃≤24h；長期保存-80℃，避免反復凍融。

 

三、第二步：病毒總RNA提取（磁珠試劑盒通用流程）

 

取200μL樣品上清加入含裂解液的1.5mL無酶管，渦旋1min，室溫靜置5min充分裂解。

 

加入20μL磁珠懸液，顛倒混勻，室溫吸附10min，每2min輕彈管壁。

 

磁力架靜置2min，徹底棄去上清，不要觸碰磁珠沉淀。

 

洗滌1：加500μL洗滌液1，重懸磁珠，吸附棄廢液；

 

洗滌2：加500μL洗滌液2，重復洗滌1次，吸凈全部廢液；

 

室溫干燥5～10min（禁止完全干透，RNA降解）；

 

加入50μLDEPC洗脫液，65℃孵育5min洗脫RNA；磁力架分離，吸取上清RNA至新無酶管，冰上備用或-80℃保存。

 

四、第三步：熒光RT-PCR反應體系配制（25μL一步法體系，冰上避光操作）

 

配液操作要點

 

按樣品數量計算預混液總量：(樣品數+3對照)×20μL，統一配制預混液，減少加樣誤差；

 

預混液渦旋混勻，瞬時離心10s；

 

每管分裝20μL預混液，再分別加入5μL對應模板；

 

蓋緊管蓋，1000g瞬時離心10s，轉移至擴增區上機。

 

五、第四步：熒光PCR擴增程序

 

反轉錄階段（1循環）：50℃，15min（RNA反轉錄為cDNA）

 

預變性（1循環）：95℃，10min

 

擴增循環（40個循環）：

 

95℃，15s（變性）

 

60℃，60s（退火延伸，此步采集FAM熒光信號）

 

熒光通道選擇：FAM；基線、閾值按儀器自動設置，必要時手動微調。

 

六、第五步：結果有效性判定（整批實驗合格前提）

 

陽性對照PC：出現典型S型擴增曲線，Ct值≤32，實驗有效；

 

NTC無模板對照、NEC陰性提取對照：無擴增曲線、無Ct值；

 

若對照不滿足，整批作廢，重新提取復測。

 

七、第六步：待測樣品判讀標準

 

陽性：出現標準S型擴增曲線，Ct≤38；

 

可疑：38＜Ct＜40，曲線微弱上揚；需重新提取RNA、重復檢測；兩次均可疑判定陽性；

 

陰性：無擴增曲線，Ct≥40，判定無豬瘟病毒核酸。

 

八、附錄：Trizol傳統RNA提取簡要步驟（無磁珠試劑盒時備用）

 

200μL樣品上清加800μLTrizol，劇烈振蕩1min，室溫5min；

 

加200μL氯仿，振蕩15s，靜置3min，12000g4℃離心15min；

 

吸取上層水相至新管，加等體積預冷異丙醇，-20℃沉淀30min；

 

12000g離心15min，棄上清，75%DEPC乙醇洗滌沉淀2次；

 

干燥3～8min，30～50μLDEPC水溶解RNA，冰上待用。

 

九、關鍵質控與注意事項

 

分區操作：樣品前處理、核酸提取、配體系、擴增四區工具、槍頭、手套完全分開；

 

RNA極易降解：全程低溫，操作快速，避免核酸酶污染；

 

氣溶膠污染防控：開蓋輕柔，離心后再開蓋，廢液、廢管121℃高壓滅菌；

 

試劑盒避光保存，酶液冰上放置，避免反復凍融；

 

組織樣品勻漿務必充分，否則病毒釋放不足導致假陰性。