一、原理

四環(huán)素類ELISA檢測試劑盒采用間接競爭ELISA方法定量檢測樣品中四環(huán)素類的殘留量。

二、適用范圍

定量檢測組織、蜂蜜、牛奶樣本中四環(huán)素類殘留。

三、四環(huán)素類ELISA檢測試劑盒特點(diǎn)及技術(shù)指標(biāo)

* 檢 測 時(shí) 間 ： 40min

  試劑盒靈敏度： 0.1ppb(µg/kg)

* 試劑盒檢測純陰性樣本的背景值＜1ppb；

* 樣品直接稀釋用于檢測，結(jié)果準(zhǔn)確；

* 試劑盒提供近工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品，使用更方便。

試劑盒檢測樣本的靈敏度和準(zhǔn)確度：

試劑盒特異性：

四、所需材料

儀器：微孔板酶標(biāo)儀450 nm/630 nm、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、天平（感量0.01 g）、離心管（5 mL, 50 mL）

微量移液器：單道 1µL～10 µL、10 µL～100µL

多道 50µL～300µL

試劑：去離子水

五、 試劑盒組成

*注：A、B、C、D、E5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為：0 ppb, 5 ppb,15 ppb, 45ppb, 135ppb，稀釋50倍使用，現(xiàn)配現(xiàn)用，配后避光放置并于半小時(shí)內(nèi)使用，具體見溶液配制。

六、溶液配制

配液1: 洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1 : 19體積比進(jìn)行稀釋，用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月，用前一天取出回溫。

配液2: 1×四環(huán)素樣品稀釋液

用去離子水將10×四環(huán)素樣品稀釋液按1: 9的體積比進(jìn)行稀釋，用于樣本的稀釋，1×四環(huán)素稀釋液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月，用前一天取出回溫。                                                         

配液3: 1×四環(huán)素提取液

  用去離子水將10×四環(huán)素提取液按1: 9的 體積比進(jìn)行稀釋，用于樣本的提取，1×四環(huán)素提取液在室溫環(huán)境可保存一個(gè)月。

配液4:  四環(huán)素工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品

七、樣本前處理                                                   

樣本處理前須知：

① 處理完的樣品應(yīng)及時(shí)進(jìn)行下步檢測，實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。② 樣本數(shù)目超過8個(gè)時(shí)推薦使用排槍加樣。

（一）蜂蜜 （原蜜、成品蜜，稀釋倍數(shù)：30）

① 稱取樣品1.0g ± 0.05g至7mL離心管中，加  入2mL 去離子水，震蕩使其溶解（若渾濁需離心）；

② 取出50μL清亮液體，加到450μL 去離子水中，混勻，取50μL直接用于分析。

（二）豬肉、魚蝦、雞肉（稀釋倍數(shù)：40）

① 稱取樣品1.0g ± 0.05g至50mL離心管中，加  入3mL  1×四環(huán)素提取液，震蕩提取2-3min；

② 4000rpm離心5min；

③ 取50μL上清液加到450μL1×四環(huán)素樣品稀釋液，混勻，取50μL用于分析。

（三）生鮮奶（稀釋倍數(shù)：1）

  取新鮮無變質(zhì)的生奶，取適量回溫后直接用于分析。

八、 酶標(biāo)免疫測定程序

• 將所有所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，待其*回升至室溫后方可使用，根據(jù)體積大小不同取出回溫的時(shí)間從1小時(shí)~3小時(shí)。注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
•  按標(biāo)準(zhǔn)品和樣品雙孔平行的數(shù)量使用微孔。
•  加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品、酶、抗體：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µL 到對應(yīng)的微孔中，加入四環(huán)素類酶標(biāo)物50µL /孔， 再加入四環(huán)素類抗體50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。
•  洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，

加入洗滌工作液250 µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

•  顯色：加入底物液A液50 µL/孔，再加底物    

液B液50 µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)10min。

•  測定：加入終止液50µL/孔，用酶標(biāo)儀立即  測定雙波長450/630nm吸光度值。

九、 結(jié)果判定

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以四環(huán)素類標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素類實(shí)際濃度。（詳見試劑盒專業(yè)分析軟件，以便進(jìn)行大量樣本的分析計(jì)算。）

十、 注意事項(xiàng)

① 根據(jù)體積大小不同取出回溫的時(shí)間從1小時(shí)~2小時(shí)，體積15毫升以上的先從冷藏環(huán)境取出回溫。

② 50*四環(huán)素標(biāo)品使用完畢后請及時(shí)放回冰箱避光保存。

③ 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

④不使用過了有效期的試劑盒，不交換使用不同批號(hào)的試劑。

⑤ 0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

⑥ 在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色    時(shí)間為15min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時(shí)間到20min，反之則減短反應(yīng)時(shí)間。

⑦ 底物液B液長期使用變?yōu)闇\藍(lán)色時(shí)，請放心使用，不影響檢測結(jié)果。

⑧ 未提及樣本請致電本公司技術(shù)服務(wù)部。

十一、貯藏條件及保存期

    貯藏條件： 2～8℃

保 質(zhì) 期： 12個(gè)月