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簡(jiǎn)要描述：本試劑盒主要用于動(dòng)物組織及血液中非洲豬瘟病毒DNA的擴(kuò)增。將組織液（包括組織研磨液、細(xì)胞懸液、血液、血清、精液、唾液、尿液等）、組織塊以及環(huán)境和拭子等樣本進(jìn)行處理后，可直接用于擴(kuò)增。本試劑盒中使用的Rapid DNA-Lysis采用du特配方，能夠快速高效的裂解各種常見(jiàn)樣本，無(wú)需反復(fù)離心，從而獲得高質(zhì)量的DNA。試劑中引入了dUTP/UDG防污染系統(tǒng)，可消除擴(kuò)增污染對(duì)qPCR的影響。
產(chǎn)品型號(hào)：廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家更新時(shí)間：2023-04-27訪 問(wèn) 量：1386非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（免提法）
試劑盒應(yīng)用
本試劑盒主要用于動(dòng)物組織及血液中非洲豬瘟病毒DNA的擴(kuò)增。將組織液（包括組織研磨液、細(xì)胞懸液、血液、血清、精液、唾液、尿液等）、組織塊以及環(huán)境和拭子等樣本進(jìn)行處理后，可直接用于擴(kuò)增。本試劑盒中使用的Rapid DNA-Lysis采用du特配方，能夠快速高效的裂解各種常見(jiàn)樣本，無(wú)需反復(fù)離心，從而獲得高質(zhì)量的DNA。試劑中引入了dUTP/UDG防污染系統(tǒng)，可消除擴(kuò)增污染對(duì)qPCR的影響。
本試劑盒僅供研究使用，不可用于食品、化妝品等領(lǐng)域。
試劑盒組成
組分 | （50次） |
Rapid DNA-Lysis | 1 mL |
熒光PCR反應(yīng)液 | 1 mL |
樣品稀釋液 | 1.5mL×4 |
陽(yáng)性對(duì)照 | 50 μL |
陰性對(duì)照 | 50 μL |
說(shuō)明書 | 1份 |
保存條件
-20oC保存。
使用前將Rapid DNA-Lysis室溫充分混勻；熒光PCR反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照溶解后需置于冰上。
需要準(zhǔn)備
熒光定量PCR儀、恒溫金屬浴、離心機(jī)、移液器
使用方法
一、不同樣品的處理方法
1. 組織液的處理
（1）組織液包括組織研磨液、細(xì)胞懸液、血清、血液、唾液、尿液、精液等。取10 μL組織液置于離心管中。
（2）加入20 μLRapid DNA-Lysis。
（3）混勻。
（4）置于55℃作用5分鐘，加入100μL樣品稀釋液，混勻后，取上清。
2. 組織塊的處理
（1）用眼科剪取半顆米粒大小的組織塊（< 3 mm3），并將組織塊剪成肉泥狀。
（2）加入20 μL Rapid DNA-Lysis。
（3）混勻。
（4）置于55℃作用5分鐘，加入100μL樣品稀釋液，混勻。
（5）8000轉(zhuǎn)離心30秒取上清。
3. 環(huán)境樣本和拭子的處理
（1）用棉簽反復(fù)涂抹桌面、鞋底、頭發(fā)、車輪等表面，并將棉棒浸泡在500ul（生理鹽水、PBS或水）中，作用5分鐘，將棉簽中液體擠壓至EP管中。
（2）吸取10 μL(1)中液體，加入20 μLRapid DNA-Lysis。
（3）混勻。
（4）置于55℃作用5分鐘。加入100μL樣品稀釋液，混勻取上清。
4. 提取對(duì)照的處理
（1）在上述1,2,3樣品處理的同時(shí)，取10 μL（生理鹽水、PBS或水）加入20 μL Rapid DNA-Lysis。
（2）混勻。
（3）置于55℃作用5分鐘，加入100μL樣品稀釋液，混勻取上清。
二、在DNase free 的離心管中配制熒光定量PCR反應(yīng)體系
陰性對(duì)照（20 μL） | 待檢樣品（20 μL） | 陽(yáng)性對(duì)照（20 μL） | 提取對(duì)照（20μL） | |
熒光 PCR反應(yīng)液 | 18 μL | 18 μL | 18 μL | 18 μL |
待檢樣品 | - | 2 μL | - | - |
陽(yáng)性對(duì)照 | - | - | 2 μL | - |
陰性對(duì)照 | 2 μL | - | - | - |
提取對(duì)照 | - | - | - | 2 μL |
三、按照以下方法設(shè)定熒光定量PCR反應(yīng)
步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
污染消化 | 37oC | 2min | 1 |
預(yù)變性 | 95 oC | 2min | 1 |
變性 | 95 oC | 10 s | 40 |
退火延伸 | 60 oC | 30s |
設(shè)置熒光基團(tuán)為Fam，淬滅基團(tuán)為BHQ，參比基團(tuán)為None。退火延伸步驟中采集熒光數(shù)據(jù)。
四、結(jié)果判定
陽(yáng)性對(duì)照：Ct值<35且有明顯擴(kuò)增曲線，呈典型的S型曲線。
陰性對(duì)照：無(wú)Ct值，無(wú)明顯擴(kuò)增曲線，結(jié)果成立。
待檢樣品：Ct值>40或無(wú)，則為陰性。
35<Ct<40，且有S形擴(kuò)增曲線，則為可疑。若無(wú)明顯擴(kuò)增曲線，則為陰性。可疑樣品需重新處理樣品后再次檢測(cè)，若Ct<40且出現(xiàn)S形曲線，則為陽(yáng)性，反之為陰性。
Ct≤35，且有明顯的S形擴(kuò)增曲線則為陽(yáng)性。若擴(kuò)增曲線呈不規(guī)則形狀需重新檢測(cè)。
注意事項(xiàng)
（1） 所有試劑應(yīng)按照規(guī)定溫度儲(chǔ)存。請(qǐng)勿反復(fù)凍融。
（2） 檢測(cè)過(guò)程應(yīng)按照分區(qū)（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)）進(jìn)行。各區(qū)物品專用，不得交叉使用，避免污染。
（3） 檢測(cè)前后均需要對(duì)操作區(qū)進(jìn)行消毒，消毒方式可以采用75%乙醇或核酸消除劑等。耗材（包括吸頭、PCR管）均需要無(wú)酶處理或使用商品化的無(wú)酶耗材。
（4） 為了避免對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，應(yīng)避免使用含有熒光物質(zhì)的手套，避免用手直接接觸各項(xiàng)試劑，預(yù)防交叉污染。
（5） 采集全血時(shí)應(yīng)當(dāng)使用jv櫞酸鈉抗凝，而不要使用肝素、EDTA。
（6） 樣品處理過(guò)程中應(yīng)當(dāng)防止交叉污染，推薦按照以下加樣順序加樣，依次為陰性對(duì)照、待檢測(cè)樣本、陽(yáng)性對(duì)照。
（7） 使用陽(yáng)性對(duì)照時(shí)應(yīng)特別注意防止污染。
（8） PCR反應(yīng)完成后，用完的PCR管直接丟棄，嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)蓋，以防止氣溶膠污染。
（9） 為防止試劑盒污染，請(qǐng)勿將不同批號(hào)試劑盒混用。
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